2026/9/9 17:09:28
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做蛋白实验这么多年每次把膜拿出来给人看对方第一句话基本都是这黑黑白白的条带哪条才是你的目的蛋白Western blot 做成黑白片大家早就习以为常了。但如果你进过配了近红外荧光成像系统的实验室可能会看到另一种画面——膜上的条带是彩色的红色一条、绿色一条甚至还能叠加出橙色同一张膜上好几个蛋白的信号清清楚楚地摆在一起。这就是很多人没见过的彩色 Western blot也就是多重荧光 Western blot。它并不是拿 Photoshop 给黑白条带“上色”而是用不同波长的荧光染料标记二抗通过扫描仪分通道采集信号最后叠加成一张多色图。这件事的本质不是“好看”而是解决传统化学发光 WB 的几个老毛病一张膜只能杂一个靶点、定量线性范围窄、内参和目标蛋白往往没法在同一次曝光里同时拿到。这篇文章我就从原理到实操把这个技术从头到尾讲透包括抗体怎么选、封闭液有什么坑、扫描参数怎么设、信号串色了怎么排查希望对正在被 WB 折磨的人有点用。1. 内容整体设计与思路拆解1.1 传统WB为什么只能出“黑白照”先说传统化学发光 WB 的完整逻辑。一抗结合到膜上的靶蛋白再用 HRP辣根过氧化物酶标记的二抗去结合一抗最后加入 ECL 底物。HRP 催化底物氧化产生光子这些光子打到 X 光片或者化学发光成像仪的 CCD 上形成灰度信号。条带越粗、越黑说明蛋白量越多。这条路线的优点很突出灵敏度高能检测到皮克级别的蛋白仪器门槛低一台普通化学发光成像仪或者暗室就能做。但缺点同样明显。第一信号是瞬态的ECL 反应的高峰期通常只有几分钟到十几分钟过一会儿信号就开始衰减所以你压片要抢时间曝光 10 秒、30 秒、1 分钟可能结果差异巨大。第二线性范围窄一般只有 1~2 个数量级条带一饱和定量基本就废了。第三一张膜只能杂一个靶点想再看另一个蛋白就得把膜 stripping洗膜把抗体剥掉重新孵育而 strip 对膜上的抗原是有损伤的本来就不多的蛋白可能越洗越弱。这些痛点堆在一起实验设计里就经常出现一个尴尬局面样本特别珍贵但一张膜只能做一个指标内参和目的蛋白还得分开曝光甚至分开杂交数据还经常因为曝光时间不同而对不上。所以业界一直在找一条路让人能在同一次实验里拿到多个蛋白的干净信号。1.2 彩色WB从哪来从预染Marker到多重荧光其实“彩色 WB”这个说法在不同实验室指的东西不完全一样。第一层是预染彩色 Marker大家应该都见过。跑胶的时候 Marker 就是彩色的转膜后这些 marker 的颜色会保留在膜上方便你判断分子量位置和转膜效率。这个只能算“彩色元素”因为目标蛋白本身的信号还是黑白的。第二层才是真正意义上的彩色 WB也就是多重荧光 Western blot。核心思路是不用 HRP 标记二抗而是用荧光染料标记的二抗。比如 Alexa Fluor 680 标记的抗兔二抗激发波长大约在 680nm 左右属于近红外波段IRDye 800CW 标记的抗鼠二抗激发波长在 800nm 左右。这两个染料发射光谱差别非常大互不干扰所以可以用一台近红外激光扫描仪分别激发、分别采集两个通道各自生成一张灰度图再在软件里上色叠加——一个通道显示红色另一个显示绿色最后输出一张彩色 WB 图。这整套体系在商业上最有名的就是 LI-COR 的 Odyssey 系列成像系统但荧光二抗并不绑定某个品牌Bio-Rad 的 ChemiDoc MP、Vilber 的 FUSION、以及一些多功能成像系统同样支持多通道荧光扫描只要激发光源和滤光片波段对得上就行。实验中用的荧光二抗也已经很普及除了 LI-COR 的 IRDye 系列Invitrogen 的 Alexa Fluor 系列、CST 推出的荧光二抗套装都是常见选择。1.3 为什么值得折腾这一套彩色WB解决了什么问题对我来说彩色 WB 最核心的价值是四个字同步定量。一张膜上可以同时检测两个甚至更多个蛋白而且内参和目的蛋白是在同一扫描条件下获取的不需要分开曝光不会出现“内参挺好但目的条带过曝”或者反过来“目的出来了内参看不见”的尴尬。这意味着定量数据的可比性大大提高重复实验之间的系统性误差也更小。第二个价值是省样本。我做过一段时间的激光显微切割样本每个样本的总蛋白可能只有几微克跑一块胶都紧巴巴的。传统 WB 想检测两个靶点加内参至少得跑三块胶、切三次膜、杂三次样本根本不够用。彩色 WB 一张膜全搞定一抗二抗混合孵育一遍流程下来三个蛋白的数据全齐了这对珍贵样本来说是降维打击式的优势。第三个价值是免 stripping。不用 strip膜上的抗原就不会经历“抗体洗脱-再封闭-再杂交”的折腾尤其对磷酸化蛋白这类本身丰度低、容易丢失表位的靶点非常友好。信号还稳定荧光标记不像 ECL 那样几分钟内衰减只要避光保存扫完的膜放几天再扫一次信号基本还能保持这对数据复核和存档非常友好。2. 核心细节解析与实操要点2.1 荧光通道与抗体搭配颜色不是随便选的做彩色 WB 之前第一个要定的就是通道组合。以最常用的近红外双通道为例700nm 通道和 800nm 通道分别对应两种不同波长的荧光二抗。实验时要把这两个通道分配给不同的宿主来源的一抗。举个具体的例子。我想同时检测磷酸化 AKTp-AKT和总 AKT这两个蛋白用传统 WB 做很麻烦因为分子量都是 60kDa 左右免疫沉淀也分不开。用荧光双通道的话我选兔源 p-AKT 一抗和鼠源 AKT 一抗二抗分别用 800CW 标记的抗兔和 680 标记的抗鼠两个通道各认各的同一个条带位置上能区分出两个信号。这里有一个绝对不能犯的错误一抗不能选同一宿主的。如果你用了两个兔来源的一抗两种荧光二抗都会识别兔 IgG那 700 和 800 两个通道就会同时出现两个蛋白的信号整个实验结果直接没法看。所以设计实验的第一步永远是确认两个一抗的宿主来源一个鼠源一个兔源是最常见的组合如果还有第三个靶点可以用鸡来源的一抗配合对应的荧光二抗。抗体稀释比例也要比化学发光 WB 稍微谨慎一点。化学发光实验里一抗浓度高了顶多背景深一点但荧光实验里抗体浓度过高会直接导致非特异性背景飙升而且这种背景在近红外通道里特别刺眼。根据我的经验一抗浓度可以在化学发光推荐浓度的基础上先减半试试比如化学发光用 1:1000荧光实验就先从 1:2000 开始根据信号强弱再调整。二抗浓度同样宁低勿高1:10000 到 1:20000 是常用区间。2.2 膜、封闭液与试剂荧光实验的隐形坑膜的选择在荧光 WB 里比化学发光要敏感得多。NC 膜硝酸纤维素膜和 PVDF 膜本身在近红外波段都有一定的背景荧光但实际比较下来NC 膜的背景通常更低尤其在 700nm 通道。我做过对比实验同样的蛋白上样量和抗体浓度NC 膜的 SNR信噪比明显优于 PVDF 膜。不过 NC 膜也有它的脾气蛋白结合能力比 PVDF 弱一些尤其是低分子量蛋白容易穿过膜转膜条件需要优化。我的做法是NC 膜用湿转电压 100V转膜时间根据分子量调整60kDa 左右的蛋白转 60 分钟没问题如果要检测小于 20kDa 的蛋白建议缩短转膜时间或者使用小孔径膜。PVDF 膜用甲醇激活后做荧光实验前可以先用 TBST 充分清洗一下再封闭能去掉一部分残留溶剂带来的背景。封闭液是另一个大坑。脱脂奶粉在近红外波段有很强的自发荧光如果你用了脱脂奶粉封闭扫描时会发现整张膜都亮堂堂的信号根本没法看。BSA 相对好一些但也存在一定的背景。商品化的荧光 WB 专用封闭液是更稳的选择比如 Odyssey Blocking Buffer、Invitrogen 的荧光封闭液这类产品是专门针对近红外通道优化过的背景能压得很低。还有几个容易忽视的细节不能用含生物素的试剂做封闭或抗体稀释因为某些荧光系统对生物素化的分子有交叉吸收抗体稀释液尽量用封闭液而不是普通 TBST因为封闭液里的蛋白组分能减少抗体非特异性吸附。洗膜用的 TBST 建议现配现用Tween-20 的浓度保持在 0.1% 左右浓了会产生泡沫背景淡了洗不干净。2.3 避光与操作流程细节决定背景高低荧光标记物对光是敏感的这个“光”包括环境光、灯光甚至扫描仪里未完全关闭的暗室照明。从二抗孵育这一步开始整个流程就要进入避光模式。我的操作习惯是二抗用铝箔纸包住的离心管稀释孵育盒子盖上盖子后外面再包一层铝箔。洗膜的时候虽然可以在普通光照下进行但我一般也把洗膜盒放在抽屉里或者盖上铝箔尽量减少荧光染料的激发降低背景。还有一个操作上的小技巧转膜之后不要急着加抗体可以先用扫描仪预扫一遍膜。这一遍能看到蛋白转移的整体情况特别是总蛋白是否均匀、有没有气泡造成的空洞这叫“转膜预检”。化学发光实验没法做这一步因为转完膜你直接封闭杂交转到膜上的蛋白看不见摸不着等抗体孵育完发现转膜不行一整天的实验就白做了。荧光 WB 多了这个优势一定要用起来。扫描参数设置上分辨率一般选 169μm 或 84μm。169μm 适合快速 pre-scan84μm 可以获得更细腻的图像用于最终发表。激光强度需要根据信号强弱来调整信号强就降低激光强度而不是降低增益这样可以保证最好的信噪比。如果目标条带特别弱可以适当增加扫描次数多次扫描叠加平均能提升信噪比但这一招会明显增加扫描时间不是首选方案。3. 实操过程与核心环节实现3.1 一个完整案例同一张膜同时检测p-AKT和AKT下面用我的一个实际实验来走一遍完整流程让你对整个操作有个具体概念。这个实验的目的是检测某种药物处理后 p-AKTSer473和总 AKT 的变化样本是贴壁细胞裂解液。实验前需要准备的试剂和材料清单如下NC 膜 0.45μm、荧光二抗680 抗鼠、800 抗兔、兔源 p-AKT 一抗、鼠源 AKT 一抗、Odyssey Blocking Buffer、TBST、预制胶或自配胶。具体操作步骤如下蛋白样本裂解、定量BCA 法测浓度后统一调整上样量。每孔上样 30μg用 10% 的 SDS-PAGE 胶分离。跑胶条件浓缩胶 80V 30 分钟分离胶 120V 60 分钟。这一步跟普通 WB 没有区别。转膜。转膜缓冲液提前预冷NC 膜先在转膜缓冲液中浸泡 5 分钟海绵、滤纸同样浸润。湿转装置按“黑面-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-白面”的顺序组装注意每层之间不要有气泡。100V 恒压转膜 60 分钟转膜槽放在冰浴中进行。转膜结束后把膜取出标记好正反面用 TBST 涮一下然后用扫描仪的预扫功能看看蛋白转移情况。如果看到清晰的蛋白条带分布说明转膜成功继续下一步。封闭。把膜放入孵育盒加入 Odyssey Blocking Buffer 完全没过膜室温在摇床上缓慢摇动 1 小时。这里如果用的不是专用封闭液而是自配的 BSA 封闭液建议浓度不要超过 3%并延长封闭时间到 1.5 小时。一抗孵育。用一抗稀释液我直接用封闭液稀释同时加入两种一抗兔源 p-AKT 按 1:2000 稀释鼠源 AKT 按 1:2000 稀释。混匀后加到孵育盒里4℃ 摇床过夜。4℃ 孵育的好处是特异性更好、背景更低。如果时间紧室温孵育 2 小时也可以但背景会相应升高。洗膜。回收一抗可以重复使用 2~3 次但磷酸化抗体尽量不回收用 TBST 洗膜 3 次每次 5 分钟摇床速度要足够快让膜表面充分接触洗涤液。二抗孵育。用封闭液按 1:10000 稀释 680 标记的抗鼠二抗和 800 标记的抗兔二抗混合后加到膜上室温避光孵育 1 小时。这一步开始所有操作都要在避光条件下进行孵育盒用铝箔纸包住。再次洗膜。TBST 洗 3 次每次 5 分钟。洗完后不要让膜干掉保持湿润状态准备扫描。注意膜一旦干透荧光信号会变得不均匀。扫描与图像采集。把膜平放在扫描仪玻璃板上用预扫模式确认膜的位置和信号强度。正式扫描时设置 84μm 分辨率、quality 选择 high两个通道分别采集。在软件中打开两张灰度图把 700 通道设为红色800 通道设为绿色叠加后就能看到一张漂亮的彩色 WB 图。3.2 扫描与数据叠加把两色信号变成一张图扫描这一步很多初次使用的人会漏掉一个关键操作一定要在扫描前把膜放置平整避免褶皱。膜不平整会导致激光焦点偏移信号虚焦条带看起来是糊的。另外膜底下如果有气泡也会造成局部信号异常。我的习惯是先用一张无尘纸吸掉膜上多余的液体然后小心地把膜放平再用扫描仪配套的压片轻轻盖住挤出气泡。扫描参数的参考设置参数建议值说明分辨率169μm预扫/ 84μm正式分辨率越高图像越细腻扫描时间越长激光强度1~5 之间信号弱时逐步增加不要一开始就拉满聚焦高度0mm膜平整时膜不平整时改为手动调节聚焦扫描通道700 800 双通道可先扫单通道确认信号强度图像格式TIF16-bit发表用 TIF不推荐 JPG数据叠加时要注意伪彩色的分配。一般来说700nm 通道的常规伪彩是红色800nm 通道的常规伪彩是绿色。如果你习惯把内参放在绿色通道、目的蛋白放在红色通道写文章的时候一定要在方法部分写清楚哪个通道对应哪个蛋白避免审稿人看糊涂。我见过有人把两个通道的颜色随意互换结果文章里图注和图对不上给审稿人留下很不好的印象。信号定量时在图像分析软件里分别圈定目的条带和背景区域计算积分光密度即峰面积×灰度值。两个通道的信号是独立的因此计算目的蛋白/内参比值时分别从各自通道读取数值不需要担心交叉干扰。这一点是荧光 WB 在定量准确性上优于化学发光的重要原因。3.3 结果呈现与报告写作要点彩色 WB 的数据呈现在图注和结果描述上比普通 WB 要更仔细。我的建议是无论你直接用假彩色叠加图还是呈现两个通道的灰度图都必须把以下几点写清楚第一一抗和二抗的稀释比、孵育时间和温度。荧光 WB 的抗体产品说明书各自差异很大审稿人对这一部分非常在意。第二扫描系统的型号和扫描参数。写清楚是用 Odyssey 还是 ChemiDoc MP分辨率多少激光强度多少。第三伪彩色的分配方式。700nm 对应什么二抗、显示为什么颜色800nm 对应什么二抗、显示为什么颜色。第四是否需要展示原始扫描图。荧光 WB 的好处是原始数据是数字化的时间戳清晰很多期刊要求提供原始图这个系统能很好地满足。有的杂志可能不太熟悉荧光 WB会质疑为什么你的内参和目的蛋白可以在同一张膜上。这时候你可以补充一句“采用多重荧光 Western blot 检测使用近红外双通道扫描仪分别采集信号”一般都能打消疑虑。如果审稿人坚持要看单个通道的原始图你也能随时从软件里导出来这个比化学发光膜拍照之后分通道再导出要方便得多。4. 常见问题与排查技巧实录4.1 高频问题速查表这些年我用荧光 WB 踩过的坑整理成一张速查表应该能帮你省不少时间。现象可能原因解决方案信号太弱条带几乎看不见一抗浓度过低蛋白上样量不足扫描激光强度设置太低提高一抗浓度或增加上样量逐步增强激光强度并重新扫描整张膜背景亮信号漂浮封闭液选择了脱脂奶粉二抗浓度过高洗膜不充分换用荧光专用封闭液或 BSA降低二抗浓度延长洗涤时间两个通道出现相同的条带两个一抗宿主来源相同荧光二抗交叉识别重新设计实验使用不同宿主的两个一抗荧光信号快速衰减隔天再看弱很多膜被环境光照射荧光染料氧化淬灭全程避光操作扫描后立即遮光保存需要复查时尽快扫描膜上有密集的黑色小点抗体稀释液里有颗粒物膜上有气泡残留使用 0.22μm 滤膜过滤抗体稀释液转膜和孵育时避免气泡条带出现明显的“微笑”或扭曲胶聚合不均匀转膜时局部发热跑胶时保持恒定低温转膜装置冰浴充分这些问题的共性规律是荧光 WB 比化学发光更敏感所以对“干净”的要求更高。很多在化学发光里能忍的背景在荧光里会变成不可接受的噪声。我刚开始做荧光 WB 时也犯过用脱脂奶粉封闭的错误整张膜在 700 通道亮得像白纸根本没法看后来换了专用封闭液才正常。4.2 一抗同源或靶蛋白分子量重叠怎么处理这是彩色 WB 设计里最棘手的问题。如果两个目标蛋白分子量接近或者相同比如 p-AKT 和 AKT 都是 60kDa两个通道虽然信号是分开采集的但位置完全重合即便颜色不同看起来也是一坨混合色定量分析会很难受。更麻烦的是如果两个蛋白的分子量相近切膜后完全分不开两个一抗同时孵育可能互相竞争导致信号失真。针对分子量重叠的情况我的建议是分三步走。第一步尽量选择分子量差异大于 20kDa 的蛋白做双色组合如果实验设计允许把分子量接近的靶点拆成不同膜来杂。第二步如果一定要在同一张膜上检测那就把膜从中间裁成两份一份孵育目标蛋白一抗另一份孵育另一个目标蛋白和内参最后再合并展示。第三步如果连裁膜都无法避免交叉那就考虑改用同分子量条件下不同修饰的检测方式比如同时检测磷酸化蛋白和甲基化蛋白用不同的抗体特异性就能区分开但这种情况对抗体要求极高一般实验室不建议轻易尝试。另外还有一个小技巧如果你特别怕分子量重叠导致信号混合可以在一抗孵育时把两种一抗分开孵育。比如先孵育兔源 p-AKT 一抗 4℃洗膜后再孵育鼠源 AKT 一抗 4℃最后再把两种二抗一起孵育。这样操作时间会变长但能保证每个一抗都是独立结合自己的靶点不会互相干扰。4.3 荧光实验的独家经验清单最后分享几个平时没人写进 protocol 但实际特别有用的细节。第一个是关于膜的正反面。NC 膜在操作时很难肉眼分辨正反面第一次做荧光 WB 的人经常把蛋白转到反面去了扫描出来信号特别弱。我的习惯是在转膜前用圆珠笔在膜的左上角做一个轻标记标记面朝上放这样后续孵育和扫描时永远知道哪一面是正面。注意笔要选耐溶剂的不然遇到甲醇和 TBST 会直接被洗掉。第二个是关于一抗的回收。荧光实验的一抗回收条件比化学发光宽松因为整个系统更温和一抗活性保持得更好。我一般会把一抗回收后放 4℃ 保存一周内重复使用一次没问题但磷酸化修饰特异性的一抗不建议回收因为这类抗体的亲和力本来就依赖表位完整性回收后特异性可能下降。第三个是扫描仪需要定期校准。近红外成像系统的激光强度会随着使用时间漂移如果很长时间不做同样条件的实验前后两次的定量结果可能不完全可比。定期用厂家提供的标准板校准或者每隔一段时间把之前扫过的膜再扫一次看看信号强度有没有变化这是保证定量数据可重复性的一条实用建议。第四个是关于转膜后的预扫。刚才提到过转膜后可以预扫膜看总蛋白分布这里我再多说一句这个预扫信号也能帮你判断上样是否均匀、转膜是否到位如果预扫结果不满意可以趁膜还没封闭直接重新转膜或重新跑胶这比在抗体孵育后发现结果不对要节省太多时间。我第一次意识到这个优势时连续拯救了两次本来要废掉的实验。写在最后彩色 Western blot 确实是一种“第一眼很惊艳、用起来很可靠”的技术。我自己用过一段时间后最大的感受是实验节奏变快了不用再纠结一张膜怎么杂两个指标不用担心 strip 把膜洗坏不用在暗室里摸黑压片数据扫描完就能直接定量。当然它也有门槛——荧光二抗比普通 HRP 二抗贵近红外扫描仪也不是每个实验室都有所以现阶段化学发光 WB 还是绝大多数实验室的主力。但如果你的课题组有荧光成像系统或者正在考虑添置成像设备我强烈建议你认真试试多重荧光 WB。从我个人经验来看这个技术对样本珍贵的课题、多指标定量需求强烈的课题能带来的帮助相当可观。最后再分享一个小技巧如果你第一次做彩色 WB 心里没底可以先拿一张只跑内参的膜练手用一个通道扫描把 PVDF 膜和 NC 膜、封闭液和抗体浓度都摸顺了以后再上双色实验。这样能把变量控制在一个比较小的范围内问题也好定位。等技术熟练以后你会发现彩色 WB 的“彩虹膜”不仅是实验室的一道风景更是你课题数据质量的一块重要拼图。
彩色Western blot（多重荧光WB）从原理到实操：一张膜同步检测多靶点
做蛋白实验这么多年每次把膜拿出来给人看对方第一句话基本都是这黑黑白白的条带哪条才是你的目的蛋白Western blot 做成黑白片大家早就习以为常了。但如果你进过配了近红外荧光成像系统的实验室可能会看到另一种画面——膜上的条带是彩色的红色一条、绿色一条甚至还能叠加出橙色同一张膜上好几个蛋白的信号清清楚楚地摆在一起。这就是很多人没见过的彩色 Western blot也就是多重荧光 Western blot。它并不是拿 Photoshop 给黑白条带“上色”而是用不同波长的荧光染料标记二抗通过扫描仪分通道采集信号最后叠加成一张多色图。这件事的本质不是“好看”而是解决传统化学发光 WB 的几个老毛病一张膜只能杂一个靶点、定量线性范围窄、内参和目标蛋白往往没法在同一次曝光里同时拿到。这篇文章我就从原理到实操把这个技术从头到尾讲透包括抗体怎么选、封闭液有什么坑、扫描参数怎么设、信号串色了怎么排查希望对正在被 WB 折磨的人有点用。1. 内容整体设计与思路拆解1.1 传统WB为什么只能出“黑白照”先说传统化学发光 WB 的完整逻辑。一抗结合到膜上的靶蛋白再用 HRP辣根过氧化物酶标记的二抗去结合一抗最后加入 ECL 底物。HRP 催化底物氧化产生光子这些光子打到 X 光片或者化学发光成像仪的 CCD 上形成灰度信号。条带越粗、越黑说明蛋白量越多。这条路线的优点很突出灵敏度高能检测到皮克级别的蛋白仪器门槛低一台普通化学发光成像仪或者暗室就能做。但缺点同样明显。第一信号是瞬态的ECL 反应的高峰期通常只有几分钟到十几分钟过一会儿信号就开始衰减所以你压片要抢时间曝光 10 秒、30 秒、1 分钟可能结果差异巨大。第二线性范围窄一般只有 1~2 个数量级条带一饱和定量基本就废了。第三一张膜只能杂一个靶点想再看另一个蛋白就得把膜 stripping洗膜把抗体剥掉重新孵育而 strip 对膜上的抗原是有损伤的本来就不多的蛋白可能越洗越弱。这些痛点堆在一起实验设计里就经常出现一个尴尬局面样本特别珍贵但一张膜只能做一个指标内参和目的蛋白还得分开曝光甚至分开杂交数据还经常因为曝光时间不同而对不上。所以业界一直在找一条路让人能在同一次实验里拿到多个蛋白的干净信号。1.2 彩色WB从哪来从预染Marker到多重荧光其实“彩色 WB”这个说法在不同实验室指的东西不完全一样。第一层是预染彩色 Marker大家应该都见过。跑胶的时候 Marker 就是彩色的转膜后这些 marker 的颜色会保留在膜上方便你判断分子量位置和转膜效率。这个只能算“彩色元素”因为目标蛋白本身的信号还是黑白的。第二层才是真正意义上的彩色 WB也就是多重荧光 Western blot。核心思路是不用 HRP 标记二抗而是用荧光染料标记的二抗。比如 Alexa Fluor 680 标记的抗兔二抗激发波长大约在 680nm 左右属于近红外波段IRDye 800CW 标记的抗鼠二抗激发波长在 800nm 左右。这两个染料发射光谱差别非常大互不干扰所以可以用一台近红外激光扫描仪分别激发、分别采集两个通道各自生成一张灰度图再在软件里上色叠加——一个通道显示红色另一个显示绿色最后输出一张彩色 WB 图。这整套体系在商业上最有名的就是 LI-COR 的 Odyssey 系列成像系统但荧光二抗并不绑定某个品牌Bio-Rad 的 ChemiDoc MP、Vilber 的 FUSION、以及一些多功能成像系统同样支持多通道荧光扫描只要激发光源和滤光片波段对得上就行。实验中用的荧光二抗也已经很普及除了 LI-COR 的 IRDye 系列Invitrogen 的 Alexa Fluor 系列、CST 推出的荧光二抗套装都是常见选择。1.3 为什么值得折腾这一套彩色WB解决了什么问题对我来说彩色 WB 最核心的价值是四个字同步定量。一张膜上可以同时检测两个甚至更多个蛋白而且内参和目的蛋白是在同一扫描条件下获取的不需要分开曝光不会出现“内参挺好但目的条带过曝”或者反过来“目的出来了内参看不见”的尴尬。这意味着定量数据的可比性大大提高重复实验之间的系统性误差也更小。第二个价值是省样本。我做过一段时间的激光显微切割样本每个样本的总蛋白可能只有几微克跑一块胶都紧巴巴的。传统 WB 想检测两个靶点加内参至少得跑三块胶、切三次膜、杂三次样本根本不够用。彩色 WB 一张膜全搞定一抗二抗混合孵育一遍流程下来三个蛋白的数据全齐了这对珍贵样本来说是降维打击式的优势。第三个价值是免 stripping。不用 strip膜上的抗原就不会经历“抗体洗脱-再封闭-再杂交”的折腾尤其对磷酸化蛋白这类本身丰度低、容易丢失表位的靶点非常友好。信号还稳定荧光标记不像 ECL 那样几分钟内衰减只要避光保存扫完的膜放几天再扫一次信号基本还能保持这对数据复核和存档非常友好。2. 核心细节解析与实操要点2.1 荧光通道与抗体搭配颜色不是随便选的做彩色 WB 之前第一个要定的就是通道组合。以最常用的近红外双通道为例700nm 通道和 800nm 通道分别对应两种不同波长的荧光二抗。实验时要把这两个通道分配给不同的宿主来源的一抗。举个具体的例子。我想同时检测磷酸化 AKTp-AKT和总 AKT这两个蛋白用传统 WB 做很麻烦因为分子量都是 60kDa 左右免疫沉淀也分不开。用荧光双通道的话我选兔源 p-AKT 一抗和鼠源 AKT 一抗二抗分别用 800CW 标记的抗兔和 680 标记的抗鼠两个通道各认各的同一个条带位置上能区分出两个信号。这里有一个绝对不能犯的错误一抗不能选同一宿主的。如果你用了两个兔来源的一抗两种荧光二抗都会识别兔 IgG那 700 和 800 两个通道就会同时出现两个蛋白的信号整个实验结果直接没法看。所以设计实验的第一步永远是确认两个一抗的宿主来源一个鼠源一个兔源是最常见的组合如果还有第三个靶点可以用鸡来源的一抗配合对应的荧光二抗。抗体稀释比例也要比化学发光 WB 稍微谨慎一点。化学发光实验里一抗浓度高了顶多背景深一点但荧光实验里抗体浓度过高会直接导致非特异性背景飙升而且这种背景在近红外通道里特别刺眼。根据我的经验一抗浓度可以在化学发光推荐浓度的基础上先减半试试比如化学发光用 1:1000荧光实验就先从 1:2000 开始根据信号强弱再调整。二抗浓度同样宁低勿高1:10000 到 1:20000 是常用区间。2.2 膜、封闭液与试剂荧光实验的隐形坑膜的选择在荧光 WB 里比化学发光要敏感得多。NC 膜硝酸纤维素膜和 PVDF 膜本身在近红外波段都有一定的背景荧光但实际比较下来NC 膜的背景通常更低尤其在 700nm 通道。我做过对比实验同样的蛋白上样量和抗体浓度NC 膜的 SNR信噪比明显优于 PVDF 膜。不过 NC 膜也有它的脾气蛋白结合能力比 PVDF 弱一些尤其是低分子量蛋白容易穿过膜转膜条件需要优化。我的做法是NC 膜用湿转电压 100V转膜时间根据分子量调整60kDa 左右的蛋白转 60 分钟没问题如果要检测小于 20kDa 的蛋白建议缩短转膜时间或者使用小孔径膜。PVDF 膜用甲醇激活后做荧光实验前可以先用 TBST 充分清洗一下再封闭能去掉一部分残留溶剂带来的背景。封闭液是另一个大坑。脱脂奶粉在近红外波段有很强的自发荧光如果你用了脱脂奶粉封闭扫描时会发现整张膜都亮堂堂的信号根本没法看。BSA 相对好一些但也存在一定的背景。商品化的荧光 WB 专用封闭液是更稳的选择比如 Odyssey Blocking Buffer、Invitrogen 的荧光封闭液这类产品是专门针对近红外通道优化过的背景能压得很低。还有几个容易忽视的细节不能用含生物素的试剂做封闭或抗体稀释因为某些荧光系统对生物素化的分子有交叉吸收抗体稀释液尽量用封闭液而不是普通 TBST因为封闭液里的蛋白组分能减少抗体非特异性吸附。洗膜用的 TBST 建议现配现用Tween-20 的浓度保持在 0.1% 左右浓了会产生泡沫背景淡了洗不干净。2.3 避光与操作流程细节决定背景高低荧光标记物对光是敏感的这个“光”包括环境光、灯光甚至扫描仪里未完全关闭的暗室照明。从二抗孵育这一步开始整个流程就要进入避光模式。我的操作习惯是二抗用铝箔纸包住的离心管稀释孵育盒子盖上盖子后外面再包一层铝箔。洗膜的时候虽然可以在普通光照下进行但我一般也把洗膜盒放在抽屉里或者盖上铝箔尽量减少荧光染料的激发降低背景。还有一个操作上的小技巧转膜之后不要急着加抗体可以先用扫描仪预扫一遍膜。这一遍能看到蛋白转移的整体情况特别是总蛋白是否均匀、有没有气泡造成的空洞这叫“转膜预检”。化学发光实验没法做这一步因为转完膜你直接封闭杂交转到膜上的蛋白看不见摸不着等抗体孵育完发现转膜不行一整天的实验就白做了。荧光 WB 多了这个优势一定要用起来。扫描参数设置上分辨率一般选 169μm 或 84μm。169μm 适合快速 pre-scan84μm 可以获得更细腻的图像用于最终发表。激光强度需要根据信号强弱来调整信号强就降低激光强度而不是降低增益这样可以保证最好的信噪比。如果目标条带特别弱可以适当增加扫描次数多次扫描叠加平均能提升信噪比但这一招会明显增加扫描时间不是首选方案。3. 实操过程与核心环节实现3.1 一个完整案例同一张膜同时检测p-AKT和AKT下面用我的一个实际实验来走一遍完整流程让你对整个操作有个具体概念。这个实验的目的是检测某种药物处理后 p-AKTSer473和总 AKT 的变化样本是贴壁细胞裂解液。实验前需要准备的试剂和材料清单如下NC 膜 0.45μm、荧光二抗680 抗鼠、800 抗兔、兔源 p-AKT 一抗、鼠源 AKT 一抗、Odyssey Blocking Buffer、TBST、预制胶或自配胶。具体操作步骤如下蛋白样本裂解、定量BCA 法测浓度后统一调整上样量。每孔上样 30μg用 10% 的 SDS-PAGE 胶分离。跑胶条件浓缩胶 80V 30 分钟分离胶 120V 60 分钟。这一步跟普通 WB 没有区别。转膜。转膜缓冲液提前预冷NC 膜先在转膜缓冲液中浸泡 5 分钟海绵、滤纸同样浸润。湿转装置按“黑面-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-白面”的顺序组装注意每层之间不要有气泡。100V 恒压转膜 60 分钟转膜槽放在冰浴中进行。转膜结束后把膜取出标记好正反面用 TBST 涮一下然后用扫描仪的预扫功能看看蛋白转移情况。如果看到清晰的蛋白条带分布说明转膜成功继续下一步。封闭。把膜放入孵育盒加入 Odyssey Blocking Buffer 完全没过膜室温在摇床上缓慢摇动 1 小时。这里如果用的不是专用封闭液而是自配的 BSA 封闭液建议浓度不要超过 3%并延长封闭时间到 1.5 小时。一抗孵育。用一抗稀释液我直接用封闭液稀释同时加入两种一抗兔源 p-AKT 按 1:2000 稀释鼠源 AKT 按 1:2000 稀释。混匀后加到孵育盒里4℃ 摇床过夜。4℃ 孵育的好处是特异性更好、背景更低。如果时间紧室温孵育 2 小时也可以但背景会相应升高。洗膜。回收一抗可以重复使用 2~3 次但磷酸化抗体尽量不回收用 TBST 洗膜 3 次每次 5 分钟摇床速度要足够快让膜表面充分接触洗涤液。二抗孵育。用封闭液按 1:10000 稀释 680 标记的抗鼠二抗和 800 标记的抗兔二抗混合后加到膜上室温避光孵育 1 小时。这一步开始所有操作都要在避光条件下进行孵育盒用铝箔纸包住。再次洗膜。TBST 洗 3 次每次 5 分钟。洗完后不要让膜干掉保持湿润状态准备扫描。注意膜一旦干透荧光信号会变得不均匀。扫描与图像采集。把膜平放在扫描仪玻璃板上用预扫模式确认膜的位置和信号强度。正式扫描时设置 84μm 分辨率、quality 选择 high两个通道分别采集。在软件中打开两张灰度图把 700 通道设为红色800 通道设为绿色叠加后就能看到一张漂亮的彩色 WB 图。3.2 扫描与数据叠加把两色信号变成一张图扫描这一步很多初次使用的人会漏掉一个关键操作一定要在扫描前把膜放置平整避免褶皱。膜不平整会导致激光焦点偏移信号虚焦条带看起来是糊的。另外膜底下如果有气泡也会造成局部信号异常。我的习惯是先用一张无尘纸吸掉膜上多余的液体然后小心地把膜放平再用扫描仪配套的压片轻轻盖住挤出气泡。扫描参数的参考设置参数建议值说明分辨率169μm预扫/ 84μm正式分辨率越高图像越细腻扫描时间越长激光强度1~5 之间信号弱时逐步增加不要一开始就拉满聚焦高度0mm膜平整时膜不平整时改为手动调节聚焦扫描通道700 800 双通道可先扫单通道确认信号强度图像格式TIF16-bit发表用 TIF不推荐 JPG数据叠加时要注意伪彩色的分配。一般来说700nm 通道的常规伪彩是红色800nm 通道的常规伪彩是绿色。如果你习惯把内参放在绿色通道、目的蛋白放在红色通道写文章的时候一定要在方法部分写清楚哪个通道对应哪个蛋白避免审稿人看糊涂。我见过有人把两个通道的颜色随意互换结果文章里图注和图对不上给审稿人留下很不好的印象。信号定量时在图像分析软件里分别圈定目的条带和背景区域计算积分光密度即峰面积×灰度值。两个通道的信号是独立的因此计算目的蛋白/内参比值时分别从各自通道读取数值不需要担心交叉干扰。这一点是荧光 WB 在定量准确性上优于化学发光的重要原因。3.3 结果呈现与报告写作要点彩色 WB 的数据呈现在图注和结果描述上比普通 WB 要更仔细。我的建议是无论你直接用假彩色叠加图还是呈现两个通道的灰度图都必须把以下几点写清楚第一一抗和二抗的稀释比、孵育时间和温度。荧光 WB 的抗体产品说明书各自差异很大审稿人对这一部分非常在意。第二扫描系统的型号和扫描参数。写清楚是用 Odyssey 还是 ChemiDoc MP分辨率多少激光强度多少。第三伪彩色的分配方式。700nm 对应什么二抗、显示为什么颜色800nm 对应什么二抗、显示为什么颜色。第四是否需要展示原始扫描图。荧光 WB 的好处是原始数据是数字化的时间戳清晰很多期刊要求提供原始图这个系统能很好地满足。有的杂志可能不太熟悉荧光 WB会质疑为什么你的内参和目的蛋白可以在同一张膜上。这时候你可以补充一句“采用多重荧光 Western blot 检测使用近红外双通道扫描仪分别采集信号”一般都能打消疑虑。如果审稿人坚持要看单个通道的原始图你也能随时从软件里导出来这个比化学发光膜拍照之后分通道再导出要方便得多。4. 常见问题与排查技巧实录4.1 高频问题速查表这些年我用荧光 WB 踩过的坑整理成一张速查表应该能帮你省不少时间。现象可能原因解决方案信号太弱条带几乎看不见一抗浓度过低蛋白上样量不足扫描激光强度设置太低提高一抗浓度或增加上样量逐步增强激光强度并重新扫描整张膜背景亮信号漂浮封闭液选择了脱脂奶粉二抗浓度过高洗膜不充分换用荧光专用封闭液或 BSA降低二抗浓度延长洗涤时间两个通道出现相同的条带两个一抗宿主来源相同荧光二抗交叉识别重新设计实验使用不同宿主的两个一抗荧光信号快速衰减隔天再看弱很多膜被环境光照射荧光染料氧化淬灭全程避光操作扫描后立即遮光保存需要复查时尽快扫描膜上有密集的黑色小点抗体稀释液里有颗粒物膜上有气泡残留使用 0.22μm 滤膜过滤抗体稀释液转膜和孵育时避免气泡条带出现明显的“微笑”或扭曲胶聚合不均匀转膜时局部发热跑胶时保持恒定低温转膜装置冰浴充分这些问题的共性规律是荧光 WB 比化学发光更敏感所以对“干净”的要求更高。很多在化学发光里能忍的背景在荧光里会变成不可接受的噪声。我刚开始做荧光 WB 时也犯过用脱脂奶粉封闭的错误整张膜在 700 通道亮得像白纸根本没法看后来换了专用封闭液才正常。4.2 一抗同源或靶蛋白分子量重叠怎么处理这是彩色 WB 设计里最棘手的问题。如果两个目标蛋白分子量接近或者相同比如 p-AKT 和 AKT 都是 60kDa两个通道虽然信号是分开采集的但位置完全重合即便颜色不同看起来也是一坨混合色定量分析会很难受。更麻烦的是如果两个蛋白的分子量相近切膜后完全分不开两个一抗同时孵育可能互相竞争导致信号失真。针对分子量重叠的情况我的建议是分三步走。第一步尽量选择分子量差异大于 20kDa 的蛋白做双色组合如果实验设计允许把分子量接近的靶点拆成不同膜来杂。第二步如果一定要在同一张膜上检测那就把膜从中间裁成两份一份孵育目标蛋白一抗另一份孵育另一个目标蛋白和内参最后再合并展示。第三步如果连裁膜都无法避免交叉那就考虑改用同分子量条件下不同修饰的检测方式比如同时检测磷酸化蛋白和甲基化蛋白用不同的抗体特异性就能区分开但这种情况对抗体要求极高一般实验室不建议轻易尝试。另外还有一个小技巧如果你特别怕分子量重叠导致信号混合可以在一抗孵育时把两种一抗分开孵育。比如先孵育兔源 p-AKT 一抗 4℃洗膜后再孵育鼠源 AKT 一抗 4℃最后再把两种二抗一起孵育。这样操作时间会变长但能保证每个一抗都是独立结合自己的靶点不会互相干扰。4.3 荧光实验的独家经验清单最后分享几个平时没人写进 protocol 但实际特别有用的细节。第一个是关于膜的正反面。NC 膜在操作时很难肉眼分辨正反面第一次做荧光 WB 的人经常把蛋白转到反面去了扫描出来信号特别弱。我的习惯是在转膜前用圆珠笔在膜的左上角做一个轻标记标记面朝上放这样后续孵育和扫描时永远知道哪一面是正面。注意笔要选耐溶剂的不然遇到甲醇和 TBST 会直接被洗掉。第二个是关于一抗的回收。荧光实验的一抗回收条件比化学发光宽松因为整个系统更温和一抗活性保持得更好。我一般会把一抗回收后放 4℃ 保存一周内重复使用一次没问题但磷酸化修饰特异性的一抗不建议回收因为这类抗体的亲和力本来就依赖表位完整性回收后特异性可能下降。第三个是扫描仪需要定期校准。近红外成像系统的激光强度会随着使用时间漂移如果很长时间不做同样条件的实验前后两次的定量结果可能不完全可比。定期用厂家提供的标准板校准或者每隔一段时间把之前扫过的膜再扫一次看看信号强度有没有变化这是保证定量数据可重复性的一条实用建议。第四个是关于转膜后的预扫。刚才提到过转膜后可以预扫膜看总蛋白分布这里我再多说一句这个预扫信号也能帮你判断上样是否均匀、转膜是否到位如果预扫结果不满意可以趁膜还没封闭直接重新转膜或重新跑胶这比在抗体孵育后发现结果不对要节省太多时间。我第一次意识到这个优势时连续拯救了两次本来要废掉的实验。写在最后彩色 Western blot 确实是一种“第一眼很惊艳、用起来很可靠”的技术。我自己用过一段时间后最大的感受是实验节奏变快了不用再纠结一张膜怎么杂两个指标不用担心 strip 把膜洗坏不用在暗室里摸黑压片数据扫描完就能直接定量。当然它也有门槛——荧光二抗比普通 HRP 二抗贵近红外扫描仪也不是每个实验室都有所以现阶段化学发光 WB 还是绝大多数实验室的主力。但如果你的课题组有荧光成像系统或者正在考虑添置成像设备我强烈建议你认真试试多重荧光 WB。从我个人经验来看这个技术对样本珍贵的课题、多指标定量需求强烈的课题能带来的帮助相当可观。最后再分享一个小技巧如果你第一次做彩色 WB 心里没底可以先拿一张只跑内参的膜练手用一个通道扫描把 PVDF 膜和 NC 膜、封闭液和抗体浓度都摸顺了以后再上双色实验。这样能把变量控制在一个比较小的范围内问题也好定位。等技术熟练以后你会发现彩色 WB 的“彩虹膜”不仅是实验室的一道风景更是你课题数据质量的一块重要拼图。 
