摘要传统BLI和SPR实验中粗样品往往面临目标配体浓度未知、背景蛋白复杂以及随机固定造成表面异质性等问题因此高质量动力学测定通常要等到蛋白纯化之后完成。SpyBLI通过SpyCatcher003–SpyTag003形成快速且不可逆的共价连接使带SpyTag的目标结合蛋白可以从哺乳细胞上清或无细胞反应液中被选择性捕获至BLI传感器并形成相对一致的配体表面。动力学分析随后使用已知浓度抗原进行多步结合和解离因此不需要首先准确知道粗样中目标配体浓度。进一步结合数字微流控无细胞表达可以直接从线性DNA进入蛋白生成和粗样动力学测量。本文重点解析SpyBLI为什么能够绕开传统纯化与浓度测定步骤以及这种设计在抗体、纳米抗体和AI蛋白候选筛选中的应用边界。关键词SpyBLI、BLI、结合动力学、KD、kon、koff、粗样检测、无细胞蛋白表达、SpyTag、SpyCatcher、抗体工程、纳米抗体、AI蛋白设计一、为什么传统动力学实验通常希望先拿到纯蛋白在SPR或BLI实验中研究人员希望传感器表面只有一种明确配体而且配体密度、方向和活性尽量稳定。如果直接把复杂细胞培养上清或者无细胞反应液拿去固定除了目标蛋白之外其他背景蛋白也可能参与非特异吸附或影响表面状态因此纯化通常成为建立可靠动力学体系的重要前置步骤。与此同时传统配体固定还经常需要知道蛋白浓度。如果不同候选实际表达量差异很大却按照相同粗样体积进行随机固定那么每个传感器上的有效配体密度就可能完全不同进一步影响动力学曲线质量。于是实验人员不仅需要纯化还需要先完成浓度测定。这种流程对于少量样品非常合理但当候选数量达到几十或上百个时纯化和定量就成为最耗时的两个环节之一。二、SpyTag–SpyCatcher为什么可以改变这个问题SpyCatcher003和SpyTag003之间能够发生快速、特异且不可逆的异肽键连接。SpyBLI把SpyCatcher相关捕获能力布置在BLI传感器表面再让带SpyTag的候选蛋白与传感器接触因此即使候选仍处于复杂粗样中真正能够稳定共价连接到对应捕获表面的主要是拥有SpyTag的目标结合蛋白。这种机制与随机吸附完全不同。它给目标分子增加了明确的“分子接口”使复杂上清中的候选能够被选择性抓取。对于大量平行表达的抗体片段或纳米抗体来说这种标签化设计能够显著减少每个候选都先经过单独层析纯化的必要性。图1SpyBLI从SpyTag结合蛋白捕获到BLI动力学分析的工作流程。共价捕获用于形成传感器配体表面随后通过抗原梯度结合与解离曲线计算kon、koff和KD三、粗样里的目标蛋白浓度不知道为什么仍然可以测动力学这里最容易产生误解的一点是认为所有BLI动力学分析都必须首先精确知道固定配体的溶液浓度。实际上SpyBLI的重点是先通过传感器捕获形成合适的表面然后在动力学阶段使用已知浓度的可溶性分析物进行结合与解离。换句话说粗样中目标配体浓度未知会影响“多快能够把传感器加载到合适水平”但它并不等同于后续动力学拟合中的分析物浓度未知。真正用于拟合结合速率的抗原浓度梯度仍然是已知的因此可以通过不同浓度下的结合曲线和后续解离过程求得kon和koff再进一步计算KD。SpyBLI由此绕开的并不是所有定量要求而是不需要在传感器加载之前先对每一个粗样中的目标结合蛋白做独立浓度定量。这一差别正是其适合高通量候选筛选的重要原因。四、为什么定向固定会影响BLI曲线质量一个抗体片段拥有明确的抗原结合区域如果随机通过蛋白表面的多个胺基或其他化学位点固定在传感器上不同分子就可能采用不同方向。有些分子的结合位点暴露充分有些可能朝向表面甚至受到空间遮挡由此形成异质配体层。SpyTag的位置可以在构建设计时控制因此多个候选通过相同标签区域与传感器形成共价连接时整体取向更加一致。这种设计有助于形成更加均一的可用结合表面并减少因为随机方向带来的额外复杂性。当然“更加定向”并不意味着任何SpyTag位置都一定不会影响目标蛋白。标签本身放在N端还是C端、是否靠近关键结构区域仍然需要根据具体抗体或结合蛋白设计否则标签也可能对表达或功能产生影响。五、为什么无细胞反应液特别适合成为SpyBLI的粗样来源哺乳细胞培养上清可以直接用于SpyBLI但如果前面仍需要载体构建、细胞转染和数天表达整个工作流的速度仍然受到表达步骤限制。因此粗样动力学与无细胞蛋白表达之间具有天然的工作流互补性。Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达体系允许线性DNA直接进入无细胞反应并通过数字微流控一次比较多个蛋白构建和不同反应环境。表达完成后的反应液本身就是SpyBLI可以利用的粗样因此两种方法之间不需要再增加细胞培养或逐个蛋白纯化作为强制接口。这使整个流程可以被设计成“DNA构建→表达条件筛选→粗样加载传感器→动力学测量”而不是传统的“DNA→克隆→细胞转染→表达→纯化→定量→动力学”。六、为什么论文还要花大量时间筛选无细胞表达条件如果SpyBLI能够直接处理粗样看起来似乎只要让蛋白表达出来就够了但对于抗体和纳米抗体而言功能取决于正确折叠而不只是总蛋白产量。论文研究中的部分纳米抗体含有非经典二硫键这些结构对于CDR3构象十分重要而还原性无细胞环境可能使二硫键形成受到限制。研究团队因此使用24个构建体×8组无细胞体系形成192种表达组合并系统比较PDI、GSSG、TrxB1、DnaK分子伴侣以及不同可溶性标签等条件。图2eProtein Discovery数字微流控体系对24个DNA构建体与8种无细胞反应环境进行组合筛选共形成192组表达条件最终研究发现去除相应可溶性标签并强化适合的氧化还原环境能够提高测试蛋白可溶产量后续12个抗体片段完成表达和纯化并通过质谱验证相应二硫键形成。这说明SpyBLI虽然能够省去“为了测动力学而进行的纯化”却不能省略“确认蛋白是否正确表达和折叠”这一生物学问题。七、为什么粗样和纯样测得的KD一致性是这篇研究最重要的数据之一一种粗样检测方法如果只是速度快但最终KD与传统纯化样品产生明显偏差那么它最多只能用于定性初筛。真正决定SpyBLI能否进入早期抗体工程筛选流程的是粗样数据与标准样品之间是否具有足够一致性。原始研究分别比较纯化蛋白、哺乳细胞表达上清以及无细胞表达混合物三种来源得到的KD高度吻合。这意味着粗样背景并没有完全破坏SpyBLI获得可靠动力学的能力。指标结果亲和力跨度6 个数量级——从高 nMNb.B201 结合 HSAKD≈772nM到低 pMIxekizumabscFv 结合 IL-17AKD≈3pM三种来源一致性纯化样品、哺乳细胞上清、无细胞表达三种来源测得的 KD 高度吻合速度从收到基因片段到拿到动力学数据24 小时样品需求仅需 10 µL 无细胞反应混合物二硫键难题含非经典二硫键的纳米抗体成功正确折叠对比传统哺乳表达需克隆转染表达约 10 天表1SpyBLI与无细胞表达组合工作流的主要验证结果八、跨度6个数量级为什么比单一“高亲和力案例”更有说服力如果一种方法只使用一个纳摩尔级抗体进行验证很难判断它是否能够处理很弱或极强的相互作用。研究中的亲和力范围从Nb.B201结合HSA的约772 nM一直到Ixekizumab scFv结合IL-17A的约3 pM跨越大约6个数量级。这一范围意味着SpyBLI并不是只针对某一种中等亲和力结合物设计而是在对应研究中能够覆盖从高nM到低pM的广泛相互作用。对于真实抗体候选库而言这非常重要因为第一轮候选通常不会全部集中在同一KD区间。九、为什么10 µL样品需求会改变候选筛选策略传统纯化通常要求先放大表达而单个SpyBLI测试只需要约10 µL无细胞反应混合物。小体积意味着研究人员可以在非常早期阶段就获得动力学信息而不需要为了测一个KD先将几十个候选分别扩大培养。这尤其适合“候选很多但大多数最终会被淘汰”的研发阶段。首先在小体积体系中获得动力学排序之后再对优先级最高的少数分子进行规模表达更符合高通量筛选的资源分配逻辑。十、SpyBLI最适合在哪个研发阶段使用SpyBLI最适合的场景并不是候选已经完成所有开发、准备最终质量确认的阶段而是候选刚刚从AI设计、展示筛选或NGS序列分析中产生需要快速进行第一轮或第二轮动力学排序的阶段。这个阶段研究人员关心的是哪些分子应该被淘汰、哪些值得进入下一轮优化以及某些序列修改究竟让kon还是koff发生了变化。粗样直接获得完整动力学信息能够让这些决策明显前移。十一、为什么AI蛋白设计尤其需要kon和koff反馈而不仅是KDAI设计模型如果只接收到“结合/不结合”标签学习到的信息非常有限如果进一步获得KD可以进行亲和力排序而如果还能获得kon和koff则能够更加细致地区分设计变体究竟改变了结合形成速度还是复合物稳定时间。对于抗体工程来说这些信息可以反过来指导下一轮序列优化。因此高通量动力学并不只是一个分析终点也可以变成设计闭环中的实验反馈数据。十二、这种方法的边界在哪里“不纯化、不测浓度”很容易被误解为后续任何验证都可以省略但实际并非如此。SpyBLI仍然依赖目标蛋白能够正确表达、SpyTag保持可用以及传感器表面加载和抗原梯度设置合理。对于进入深入开发阶段的候选仍然需要纯化蛋白进行结构、稳定性、聚集、功能和其他质量分析。SpyBLI的真正价值是在高通量候选阶段减少不必要的前置操作而不是彻底替代传统蛋白制备和生物物理表征。十三、总结SpyBLI能够从粗样中测量动力学的关键并不是BLI突然不再需要任何定量信息而是SpyTag–SpyCatcher共价捕获将“目标配体的选择性固定”和“后续已知浓度抗原的动力学测量”分成两个步骤使粗样中的目标蛋白浓度不再成为每一个候选必须先单独解决的问题。与无细胞表达连接之后这一设计可以进一步把候选蛋白生成、表达优化和KD/kon/koff测量压缩到更加紧凑的工作流中。对于AI蛋白设计、纳米抗体和高通量抗体序列验证这种方法的意义在于把高质量动力学数据提前到候选数量仍然很多的阶段。参考文献Predeina O, Atkinson M, Wissett O, et al. The SpyBLI cell-free pipeline for the rapid quantification of binding kinetics from crude samples.RSC Chemical Biology. 2025, 6, 1313–1327. DOI:10.1039/d5cb00079c.拓展阅读Nuclera eProtein Discovery无细胞表达与蛋白筛选更多技术资料关于技术来源本文基于SpyBLI公开研究及Nuclera无细胞蛋白表达相关技术资料曼博生物MineBio整理用于科研信息分享、实验参考和粗样结合动力学测量原理理解。文中SpyCatcher003–SpyTag003、24×8组合筛选、192组条件、10 µL样品需求、KD约772 nM至约3 pM以及三种样品来源一致性等结果均对应原研究体系不应直接外推至所有蛋白、抗体和BLI平台。实际应用仍需根据目标结合蛋白表达量、折叠状态、SpyTag位置、传感器加载水平和分析物浓度范围进行方法验证。本文围绕SpyBLI、SpyTag、SpyCatcher、BLI、KD、kon、koff、无细胞抗体表达和AI蛋白设计等方向整理相关公开技术信息。